|
|
Каталог файлов
ТРАНСФОРМАЦИЯ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ ВЫСОКООКИСЛЕННОГО БУРОГО УГЛЯ БАЗИДИАЛЬНЫМИ ГРИБАМИ СКАЧАТЬ БЕСПЛАТНО
|
[ Скачать с сервера (1.02 Mb)
]
| 06.06.2015, 13:20 |
С того момента, когда Коэн и Габриель в 1982 г.
впервые показали, что грибы могут расти непо
средственно на угле и метаболизировать его [1],
процессы биологической конверсии угля, прежде
всего, бурого, являются предметом многочислен
ных исследований [2–7].
В последнее время интерес к биоконверсии уг
ля неуклонно растет, что обусловлено негативны
ми последствиями для окружающей среды, воз
никающими при использовании угля в качестве
источника энергии. Особенно актуальна эта про
блема для стран, характеризующихся высоким
уровнем производства угля, к которым относится
и Россия, занимающая второе место после ФРГ
по этому показателю. Производство бурого угля в
нашей стране составляет около 90 млн. т в год [8].
По сравнению с конверсией химическими или
физическими методами, микробиологические и
энзиматические способы обладают рядом преиму
ществ, такими, как отсутствие необходимости со
здания повышенных температур и давления [9].
Несмотря на перспективность использования
биологического подхода для конверсии угля, его
разработка требует тщательного выбора микроор
ганизма, на основе которого планируется создание
технологий биоконверсии. Это обусловлено осо
бенностями угля как субстрата, накладывающими
целый ряд ограничений на предлагаемый микро
организм. Одно из основных свойств угля – его
токсичность, которая затрудняет его биодеграда
цию, объясняется присутствием труднодеградиру
емых соединений, например, полиядерных арома
тических углеводородов, а также высокая гетеро
генность структуры и твердофазное состояние [8].
Указанные негативные, с точки зрения биотранс
формации, свойства угля определяют относитель
но небольшой спектр микроорганизмов, способ
ных к его разложению, к которым, прежде всего,
относятся базидиальные грибы – продуценты
лигнолитических ферментов. Они принадлежат
к немногочисленной группе микроорганизмов,
обладающих уникальной системой экстрацел
люлярных лигнолитических ферментов и спо
собных благодаря этому разрушать труднодегра
дируемые вещества со сложной структурой фе
нольной природы, такие, как лигнин и уголь.
Установлено, что ведущую роль в этом процессе
играет лигниндеградационная система, в кото
рую входят ферменты лигнолитического ком
плекса: лигнинпероксидаза, Mnпероксидаза и
лакказа, а также низкомолекулярные вторичные
метаболиты [10–14]. Эффективность процесса
деградации лигнина под действием этой систе
мы в значительной мере зависит от доступности
источника углерода. Показано, что присутствие
в питательной среде легкодоступного источника
углерода интенсифицирует процесс биодеграда
ции лигнина [14]. Однако взаимосвязь между
ТРАНСФОРМАЦИЯ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ ВЫСОКООКИСЛЕННОГО
БУРОГО УГЛЯ БАЗИДИАЛЬНЫМИ ГРИБАМИ
Trametes hirsuta И Trametes maxima
© 2013 г. О. И. Кляйн*, Н. А. Куликова*, **, А. И. Константинов***, Т. В. Фёдорова*,
Е. О. Ландесман*, О. В. Королёва*
*Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, 119071
e mail: klein_olga@list.ru
**Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, факультет почвоведения, Москва, 119991
***Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет, Москва, 119991
Поступила в редакцию 19.09.2012 г.
Исследована способность базидиальных грибов белой гнили Trametes hirsuta и Trametes maxima транс
формировать гуминовые вещества (ГВ) угля в условиях твердофазного культивирования в присут
ствии и отсутствие легкодоступного источника углерода (глюкоза). Показано, что в процессе роста
выбранных штаммов грибов на средах, содержащих ГВ, одновременно протекают деструктивные и
конденсационные процессы трансформации ГВ. На основании сравнительного физикохимического
анализа исходных и трансформированных грибами ГВ установлено, что, хотя внесение глюкозы мо
жет способствовать более глубокой трансформации ГВ базидиомицетами, общее направление их мо
дификации – преимущественное восстановление или окисление – определяется физиологобиохи
мическими особенностями штамма.
DOI: 10.7868/S0555109913030100
УДК 579.222
ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ том 49 № 3 2013
ТРАНСФОРМАЦИЯ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ ВЫСОКООКИСЛЕННОГО БУРОГО УГЛЯ 293
эффективностью деградации угля и составом
питательной среды остается неизученной.
Цель работы – сравнительное изучение биоде
градации бурого угля под действием продуцентов
высокоактивных пероксидаз и лакказ – базидио
мицетов Trametes hirsuta и Trametes maxima на пол
ной питательной среде и при недостатке легкодо
ступного источника углерода (бедная среда).
МЕТОДИКА
При проведении экспериментов использовали
штаммы T. hirsuta (Wulf.:Fr.) Pil. и T. maxima
(Mont.) David & Rajchenb из коллекции культур
Ботанического института им. В.Л. Комарова
РАН. Для изучения деградации угля выбранными
штаммами базидиальных грибов проводили их
твердофазное культивирование на угле высокой
степени разложения – леонардите (Солнцевское
месторождение, о. Сахалин) согласно [15].
При твердофазном культивировании в колбы
объемом 750 мл вносили 20 г измельченного лео
нардита с размером частиц ≤1 мм и 5 мл полной или
бедной питательной среды. При выращивании
грибов на полной среде использовали питательную
среду следующего состава (г/л): глюкоза – 10.0;
пептон 3.0; – NaNO3 – 3.0; КН2РО4 – 0.6; ZnSО4 ⋅
⋅ 2Н2О – 0.001; K2НРО4 – 0.4; FeSО4 ⋅ 7Н2О – 0.0005;
MnSО4 ⋅ 7Н2О – 0.05; MgSО4 ⋅ 7Н2О – 0.5; CaCl2 –
0.5; CuSО4 – 0.25; рН 6.0). Среда без легкодоступ
ного источника углерода (бедная) имела анало
гичный состав, но не содержала глюкозы. Далее
проводили засев субстрата мицелием базиди
альных грибов (объем инокулята 20 мл). В ходе
эксперимента влажность в колбах поддержива
ли на уровне 80–90%. Стерилизацию угля про
водили путем автоклавирования (120°С, 1 атм.,
30 мин). Культивирование проводили в течение
30 сут при 28°С.
Для оценки функционального состояния вы
ращиваемых базидиальных грибов при культиви
ровании проводили мониторинг основных фер
ментов, входящих в лигнолитический комплекс:
лигнинпероксидазы, Mnпероксидазы и лакказы.
Определение активности лигнинпероксидазы.
Активность фермента оценивали по скорости
окисления вератрового спирта до вератрового
альдегида, измеряя снижение поглощения при
310 нм в 0.1 М Naтартратном буфере, рН 3.0 [16].
Определение активности Mn7пероксидазы. Ак
тивность фермента определяли согласно [17], ис
пользуя в качестве субстрата Mn2+. За единицу ак
тивности принимали окисление 1 мкмоль Mn(II)
за 1 мин.
Определение активности лакказы. Активность
лакказы определяли спектрофотометрически при
длине волны 410 нм, используя в качестве хромо
генного субстрата 10 мМ катехол в 0.1 М Naаце
татном буфере, рН 4.5 [18]. За условную единицу
активности принимали увеличение оптической
плотности на 1 ед. за 1 мин. Скорости фермента
тивных реакций регистрировали на спектрофото
метре “PerkinElmer” (США). Для перевода фер
ментативных активностей в международные еди
ницы (МЕ) проводили нормирование условных
единиц на коэффициент экстинкции использо
ванного субстрата.
Для контроля структурных изменений леонар
дита при культивировании базидиальных грибов,
после окончания эксперимента проводили выде
ление из него гуминовых веществ (ГВ) и последу
ющую характеристику их физикохимических
свойств. Для этого к леонардиту прибавляли 0.1 М
NaOH в весовом соотношении 1 : 2, получаемую
кашеобразную массу количественно переносили
в диализный мешок с размером пор 12–14 кДа и
диализовали против дистиллированной воды 48 ч
с многократной сменой воды при комнатной
температуре для удаления избытка щелочи. За
тем ГВ центрифугировали в течение 20 мин при
3000 g и собирали супернатант. Полученный рас
твор ГВ высушивали в сушильном шкафу при
температуре 50°С. В качестве контрольного об
разца использовали ГВ, полученные из леонар
дита, прошедшего аналогичную обработку (ав
токлавирование, добавление питательных сред,
инкубирование), но без внесения грибов. Харак
теристику основных физикохимических свойств
ГВ проводили по таким параметрам, как элемент
ный состав, молекулярная масса и структурно
групповой состав.
Элементный анализ. Анализ C, H и N был вы
полнен на элементном анализаторе модели 1106
фирмы “Carlo Erba Strumentazione” (Италия). Со
держание кислорода рассчитывали по разнице
между массой навески и суммарным содержани
ем золы и СНN. Зольность определяли сжигани
ем препарата в муфельной печи (850°С, 40 мин).
Определение молекулярной массы. Молекуляр
ную массу ГВ определяли с помощью эксклюзи
онной хроматографии по методике, описанной в
работе [19]. Фракционирование препаратов осу
ществляли на колонке, заполненной гелем Toyo
pearlHW50(S) (Япония), в качестве калибровоч
ных веществ использовали полистиролсульфона
ты с молекулярными массами 4.48, 14.0, 20.7, 45.1
и 80.8 кДа (“Polymer Standard Service” Германия).
Концентрация ГВ в анализируемых пробах со
ставляла 40 мг/л. Подвижной фазой служил фос
фатный буфер (0.028 M, pH 6.8), скорость элюиро
вания составляла 1 мл/мин. Регистрацию ГВ на
выходе из колонки проводили с помощью УФде
тектора по поглощению при 254 нм. Расчет сред
невесовых молекулярных масс (ММ)
|
|
Категория: Биотехнология | Добавил: Pshtd
| Теги:
|
| Просмотров: 252 | Загрузок: 148
| Рейтинг: 0.0/0 |
Добавлять комментарии могут только зарегистрированные пользователи. [ Регистрация | Вход ]
|
|