ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОЛИСАХАРИДОВ, ВЫДЕЛЕНЫХ ИЗ МИЦЕЛИЯ МЕСТНЫХ ШТАММОВ GANODERMA LUCIDUM Бабицкая В.Г.1, Щерба В.В.1, Смирнов Д.А.1, Бисько Н.А.2, Филимонова Т.В.1, Поединок Н.Л.2 1 Институт микробиологии НАН Беларуси, Беларусь, Минск 2 Институт ботаники НАН Украины, Украина, Киев Для исследований было взято два штамма. Штаммы выделены из пло- довых тел гриба, собранных в различных областях Беларуси. Отличаются от контрольного (КНДР) сильной пигментацией мицелия. При глубинном культивировании на глюкозо-пептонной среде и пивным сусле выход био- массы у этих штаммов достигал 10-12 г/л. Эндополисахариды составляли 7,5-9,0%, экзополисахариды – 6,5-7,0 г/л. Сравнительный анализ показал, что местные штаммы близки зарубежным аналогам по содержанию белка, липидов, эндополисахаридов, превосходят их по ферментативной (лигно- литической) активности и синтезу экзополисахаридов. Белорусские штаммы G. lucidum также как и контрольный вариант (штамм №362) секретируют полисахариды, которые слабо растворяются в воде без нагревания. Это особенно касается экзополисахаридов. Так, эк- зополисахариды обоих штаммов лишь частично растворялись в воде при нагревании, значительно лучше – в щелочах, особенно в 10 % NaOH. Эндополисахариды, в отличие от экзополисахаридов, при нагревании полностью растворялись в воде и в щелочах, слабых растворах неоргани- ческих и органических кислот. Важной характеристической особенностью полисахаридов является вязкость. Кинематическая вязкость 0,1% растворов эндополисахаридов обоих штаммов незначительно превосходила вязкость воды (0,89 мм2/с) и составляла 0,92 и 0,94 мм2/с. В то же время показатель вязкости водо- и щелочерастворимых экзополисахаридов превосходил таковой воды: 1,90 и1,95 мм2/с – водорастворимая и 2,10 и 2,25 мм2/с – щелочерастворимые фракции. Водные растворы углеводов, как правило, оптически активны и способ- ны вращать плоскость поляризации света. Удельное вращение плоскости поляризации 0,1% водным раствором эндополисахаридов составило [α]D20 + 15,5° (штамм 8) и + 20,0° (штамм 10). Для водо- и щелочерастворимых фракций экзополисахаридов этот показатель равнялся [α]D20 – 30° и – 35° (штаммы 8 и 10) и [α]D20 + 20,2° и 25,0°. По данным литературы многие иммуностимулирующие и противоопу- холевые полисахариды, получаемые из плодовых тел и мицелия грибов, содержат в своем составе белок (до 10 – 50% по сухому весу). Методом Бредфорда установлено присутствие белка (пептидных остатков) во 140 Успехи медицинской микологии фракциях эндополисахаридов в количестве 2,5 и 3,0% (штаммы 8 и10), водорастворимых экзополисахаридов – 3,9 и 4,2% и щелочерастворимых полисахаридов – 2,0 и 2,5%. В аналогичных фракциях контрольного штамма (№362) содержание белка составляло 1,5% (внутриклеточные полисахари- ды) и 3,9 и 1,2% (внеклеточные полисахариды). Анализ аминокислотного состава гидролизатов экзо- и эндополисахаридов гриба двух штаммов показал наличие в них 17 аминокислот. В результате деления растворов экзо- и эндополисахаридов на колонке с ДЭАЕ целлюлозой были получены следующие фракции: Водная фракция эндополисахаридов – эндополисахариды, элюиру- емые с носителя дистиллированной водой. Солевая фракция эндополисахаридов – эндополисахариды, элюиру- емые с носителя 1М NaCl. Водная фракция экзополисахаридов – экзополисахариды, элюируе- мые с носителя дистиллированной водой. Солевая фракция экзополисахаридов – экзополисахариды, элюиру- емые с носителя 1М NaCl. Во всех случаях преобладала количественно водная фракция. Гель-хроматография эндополисахарида G. lucidum штамм 8 на Toyopearl HW-75 позволила установить, что его молекулярный вес находится в области 2 000 кДа. При нанесении фракции водорастворимых экзополисахаридов был получен один пик вне области деления колонки. Вероятно, молекуляр- ный вес гликана был менее 70 кДа. В результате гель-фильтрации фракции щелочерастворимых экзополисахаридов G. lucidum было получено два пика: минорная фракция с молекулярным весом менее 70 кДа и преобла- дающая фракция с молекулярным весом порядка 2 000 кДа. Близкие мо- лекулярные массы имели полисахариды другого штамма − G. lucidum 10: молекулярная масса эндополисахаридов находилась в пределах 1800 кДа, экзополисахаридов – 50 и 1500 кДа. Сравнительный анализ молекулярных масс полисахаридов местных штаммов с таковыми контрольного (№ 362) не показал значительных различий. Изучение мономерного состава эндо- и экзополисахаридов местных штаммов G. lucidum показало, что они явля- ются гетерогликанами. Определение конфигурации мономеров, входящих в состав полисахаридов гриба, выявило, что все сахара (как у местных штаммов, так и у контрольного) относятся к D-ряду. В гидролизатах обоих фракций эндополисахаридов преобладала D глюкоза (более 90%). Преобладающим мономером в экзополисахаридах также оказалась глюкоза. Значимых различий в мономерном составе водной и щелочной фракций не обнаружено. Местные штаммы по мономерному составу полисахаридов близки к контрольному варианту. ИК-спектры фракций экзо- и энодполисахаридов G. lucidum обнару- жили большое сходство между собой и характеризовались интенсивными полосами поглощения в области 1100-1000 см-1, характерными для класса углеводов в целом. В спектрах поглощения полисахаридов явно наблюда- • • • • Том IX. Глава 5 141 ется асимметрия пика в области 3050-3200 см-1 (NH-водородносвязанный) и наличие пиков в областях 1650 (амид I) и 1550 (амид II), что является подтверждением того, что полисахариды исследуемых грибов содержат белковую часть. В спектрах водо- и щелочерастворимых фракций экзополисахаридов отмечены полосы 890 и 1370 см-1, указывающие на наличие α-гликозид- ных связей. Одновременно есть полосы поглощения при 920, 840 и 760 см-1, характерные для α-аномера. Полученные результаты согласуются с данными других исследователей, которые также зафиксировали наличие в водорастворимой фракции экзополисахаридов G. lucidum как ß- так и α- гликозидных связей. Как и в случае экзополисахаридов, в обеих фракциях эндополисахаридов присутствуют пики, соответствующие как ß-, так и α- типам гликозидной связи. Для всех фракций экзо- и эндополисахаридов G. lucidum ß-связь выражена ярче. Для определения положения гидроксилов, соединяющих моносахарид- ные звенья в молекуле полисахарида, широко применяется деградация по Смиту. При периодатном окислении и боргидридном восстановлении всех фракций полисахаридов происходило потребление периодата натрия и образовывалась муравьиная кислота. Продуктами мягкого гидролиза вос- становленных полисахаридов являлись глицерин и эритрит. Образование глицерина наряду с муравьиной кислотой говорит о присутствии (С1→ С6) связей, эритрит указывает на присутствие (С1→С4) связей. Наличие непрогидролизовавшегося остатка указывает на присутствие (С1→С3) связанных моноз, поскольку последние не имеют углеродных атомов, не- сущих α-диольные группы и не окисляются периодатом. Жесткий гидролиз остатка обнаружил неокисленные метапериодатом натрия молекулы гексоз, что подтверждает наличие (С1→С3) связей в углеводной цепи полимера. Таким образом, все фракции полисахаридов гриба G. lucidum шт. №8 и 10 являются разветвленными структурами. Поскольку не окисляемый периодатом остаток полисахарида преобладает во всех фракциях, можно предположить, что основные цепи гликанов как эндо-, так и экзополисаха- ридов образованы С1→С3 связанными остатками гексоз. В боковых цепях полисахаридов присутствуют С1→С4 и С1→С6 гликозидные связи между мономерами. Внутриклеточные полисахариды содержат преимущественно С1→С4 связи в боковых цепях молекул гликанов в отличие от внеклеточных, где соотношение С1→С4 и С1→С6 связей приблизительно равно.